Skip to content

zjazd ortopedów wrocław 2014

2 miesiące ago

567 words

Immunoreaktywne substancje obecne w szczurzym osoczu scharakteryzowano za pomocą HPLC. Próbki, potraktowane wkładem Sep-Pak C18, naniesiono na HPLC z odwróconymi fazami stosując kolumnę Inertsil ODS-2 C18 (4,6 x 250 mm, GL Science Inc. Tokyo, Japonia) i elucję acetonitryl / 0,1% TFA w 20% acetonitryl w ciągu pierwszych 5 minut, a następnie liniowy gradient acetonitrylu w zakresie od 20% do 60% przez 30 minut przy szybkości przepływu ml / minutę. Sekwencję aminokwasową immunoreaktywnej frakcji zbadano przy użyciu automatycznego sekwenatora fazy gazowej i masę cząsteczkową tego peptydu analizowano za pomocą spektrometrii mas. Ponadto, reaktywność krzyżową anty-czynnika sprzęgającego 6 Ab sprawdzono za pomocą analizy Western blot z użyciem wyciągu z serca. Pokrótce, serca z SHR gotowano w wodzie przez 10 minut i ekstrahowano M kwasem octowym. Po odsoleniu przez kolumnę Sep-Pak C18, a następnie strąceniu acetonem w stężeniu 66%, powstały supernatant odparowano pod próżnią aż do wyschnięcia. Wyciąg z serca poddano SDS-PAGE, stosując żel gradientowy. Białko przeniesiono elektroforetycznie na membranę nitrocelulozową, potraktowano czynnikiem antysprzęgowym 6 Ab i barwiono zestawami immunoblot zamplifikowanej fosfatazy alkalicznej. Oznaczanie ekspresji genu czynnika sprzęgającego 6. Całkowity RNA został przygotowany z aorty przy użyciu systemu oczyszczania Trizol RNA. CDNA przygotowano z mRNA ze starterami oligo (dT) (30 ng / u g RNA) stosując odwrotną transkryptazę MMLV i warunki zalecane przez producenta. CDNA amplifikowano w 100 .l mieszaniny reakcyjnej PCR (8 mM końcowe stężenie dNTP) zawierającej 2,5 U polimerazy Taq w buforze dostarczonym przez producenta i 0,5 .M starterach. Startery oligonukleotydowe zaprojektowane na N-końcowym regionie czynnika sprzęgającego 6 (31) były starterem do przodu 5a-TGTCCTTCGGTCAGCAGTCTC-3. i primer odwrotny 5. -AACTTATCCATCTCTCCTTTA-3 .. Produkty PCR rozdzielono na 1,7% żelu agarozowym zawierającym 0,001% bromku etydyny i sfotografowano w promieniowaniu ultrafioletowym przy 320 nm. Aby ocenić względne ilości cDNA, przeprowadzono drugą amplifikację PCR ze starterem skierowanym do genu ratunkowego szczura GAPDH, jak opisano wcześniej (32). Wszystkie procedury PCR przeprowadzono w następujący sposób: 25 cykli dla czynnika sprzęgającego 6 i GAPDH (45 sekund w 94 ° C, 45 sekund w 52 ° C dla współczynnika sprzężenia 6 i 45 sekund w 62 ° C i minuta w 72 ° C dla GAPDH ) i końcowe wydłużenie (5 minut w 72 ° C). Mikroskopia immunofluorescencyjna. Komórki CRL-2222 wysiano w ilości 5 x 105 komórek / ml na szklanych szkiełkach nakrywkowych i pozostawiono do przylgnięcia przez noc w minimalnym niezbędnym medium Earle zawierającym 10% FBS. Komórki inkubowano w 4 ° C przez godzinę w PBS, pH 7,0, zawierającym 1% BSA z króliczą poliklonalną surowicą odpornościową podniesioną przeciwko czynnikowi sprzęgającemu 6 syntazy ATP lub surowicy królika przed immunizacją. Komórki przemyto i inkubowano w temperaturze 4 ° C przez godzinę w ciemności z kozim anty-króliczym IgG skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny przed płukaniem. Mikroskopię immunofluorescencyjną przeprowadzono przy użyciu mikroskopu Olympus BX-60 (Olympus, Tokio, Japonia). Pomiar ciśnienia krwi. Ciśnienie krwi określano przez bezpośrednie kaniulowanie tętnic u szczurów znieczulonych 75 mg / kg chlorowodorku ketaminy i 15 mg / kg chlorowodorku ksylazyny. Dwa cewniki polietylenowe wypełnione heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej (20 heparyna / ml) wprowadzono odpowiednio przez lewą tętnicę szyjną i lewą żyłę udową. Cewnik tętnicy szyjnej był połączony z przetwornikiem ciśnienia połączonym z poligrafem. Rekombinowany czynnik sprzęgający szczura 6, czynnik antysprzęgowy 6 Ab, niespecyficzna anty-królicza IgG i bradykinina w 100. L soli fizjologicznej, wstrzyknięto i przepłukano dodatkową 200. L solą fizjologiczną do żyły głównej
[patrz też: mięsak kości, kupis dermatolog kielce, niskorosłość ]

0 thoughts on “zjazd ortopedów wrocław 2014”