Skip to content

sklep daniel wrocław

2 miesiące ago

557 words

Prądy rejestrowano w temperaturze pokojowej (20. 22 ° C) w konfiguracji patch-clamp dla całej komórki przy użyciu wzmacniacza patch-clamp EPC9 i oprogramowania Pulse + Pulsefit (HEKA Elektronik, Lambrecht, Niemcy). Roztwór zewnątrzkomórkowy zawierał (w mM) 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 5 HEPES, 10 glukozy i 20 sacharozy (pH 7,4 z NaOH). Roztwór wewnątrzkomórkowy zawierał (w mM) 120 K-glukonian, 20 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2 (pH 7,3 z KOH) i mM 8-Br-cAMP, o ile wskazano. Oporność serii wahała się od 4. 7 M. i zostały skompensowane elektronicznie (60. 80%). Komórki zaciśnięto przy ~ 20 mV i hiperpolaryzowano do potencjałów od ~ 40 mV do ~ 120 mV przez 5 sekund. Ponadto zastosowano 2-sekundowe impulsy testowe do ~ 140 mV i 15-sekundowe impulsy testowe do 110 110 mV. Zależność napięciową aktywacji analizowano przez dopasowanie funkcji Boltzmanna (I-Imin) / (Imax-Imin) = / (1. Exp [(V. V1 / 2) / współczynnik nachylenia)) do prądów końcowych przy 20 mV lub 30 mV. Stałe czasowe aktywacji zostały określone przez dopasowanie pojedynczych wykładników do bieżących śladów trwających 15 sekund. Wszystkie dane są podane jako średnie. SEM. Wyniki Struktura genomowa i lokalizacja chromosomowa genu HCN4 Strukturę genomową genu HCN4 zdefiniowano na podstawie kilku kont genomicznych zidentyfikowanych przez przeszukiwanie bazy danych bazy danych NCBI GenBank htgs. Zidentyfikowano osiem egzonów, porównywalnych ze strukturą genu HCN2 (17) (Tabela 2 i Figura 2a). W zgodzie z chromosomalną hybrydyzacją in situ (18), gen HCN4 był zlokalizowany na chromosomie 15q23q24.1 w pobliżu mikrosatelity D15S215 (dane nie przedstawione). Tabela 2Exon / granice intronu genu HCN4 Detekcja mutacji w genie HCN4 Sekwencjonowaliśmy geny HCN4 10 niepowiązanych pacjentów z indeksem. W przypadku jednego pacjenta indeksu wykrywaliśmy heterozygotyczną delecję pojedynczej pary zasad (1631delC) w eksonie 5 genu HCN4 (Figura 2b). Delecja dała początek nowemu miejscu restrykcyjnemu EciI, które również zastosowano do wykrywania mutacji (Figura 2c). Trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA z trzech dostępnych zdrowych dzieci tego pacjenta indeksu nie wykazało mutacji. Przeszukiwanie genomowego DNA z próbki ogólnej populacji (362 chromosomy) nie wykryło mutacji, co sprawia, że obecność polimorfizmu jest mało prawdopodobna. Mutacja 1631delC w eksonie 5 spowodowała przesunięcie ramki odczytu, które prowadzi do skróconej otwartej ramki odczytu (P544fsX30) i tym samym wyeliminowało cNBD HCN4. Przewiduje się, że zmutowane białko ma długość tylko 572 aminokwasów (HCN4-573X) i kończy się niezwiązaną z HCN4 sekwencją 29 aminokwasów (reszty 544. 572) (Figura 2d). Immunobarwienie i wewnątrzkomórkowy transport dzikich i zmutowanych podjednostek HCN4 W celu zbadania subkomórkowej lokalizacji i wewnątrzkomórkowego przemytu HCN4-573X, komórki COS-7 przejściowo transfekowano znakowanymi konstruktami HCN4. Późniejsza mikroskopia konfokalna wykazała podobne wzory barwienia immunologicznego o porównywalnej intensywności z przeciwciałami skierowanymi przeciwko znakowanym białkom HCN4 lub HCN4-573X. Wybitną immunoreaktywność wykryto w obszarach okołojądrowych i na błonie komórkowej komórek COS-7 (Figura 3, aib). Wzorce immunobarwienia HCN4 i HCN4-573X całkowicie pokrywały się, gdy koherentne ulegały podjednostki HCN4 typu dzikiego i zmutowane (fig. 3, c do e). Obserwowana zachodząca na siebie immunoreaktywność w błonach komórkowych (Figura 3f) sugerowała, że podjednostki były kolokalizowane. Tak więc wyniki immunohistochemiczne wskazywały, że wewnątrzkomórkowe przemiany i przetwarzanie białek HCN4 i HCN4-573X były podobne. Funkcjonalna ekspresja dzikiego typu i zmutowanych kanałów HCN4 Całą konfigurację komórkową techniki patch-clamp wykorzystano do funkcjonalnego scharakteryzowania kanałów HCN4-573X przejściowo wyrażanych w komórkach COS-7
[patrz też: nefropatia cukrzycowa, mastocytoza, paweł gutral ]

0 thoughts on “sklep daniel wrocław”