Skip to content
4 miesiące ago

543 words

Elementy strukturalne, takie jak promotory (PCMV, PEF-1 a), IRES i sygnały poliadenylacji są pokazane w otwartych polach. Produkty PCR amplifikowane z całkowitego transkryptu RNA z odwrotną transkrypcją są oznaczone poziomą linią powyżej otwartych ramek odczytu HCN4. Położenie miejsca restrykcyjnego EciI jest oznaczone pionową strzałką. pA, sygnał poliadenylacji. (b) Elektroforeza w żelu agarozowym produktów RT-PCR z trawionym EciI amplifikowana z całkowitego RNA przejściowo transfekowanych komórek COS-7. Fragment typu dzikiego ma rozmiar 353 bp i nie zawiera miejsca restrykcyjnego EciI. Przeciwnie, zmutowany fragment PCR o długości 352 bp (573 X) jest trawiony przez EciI (patrz Figura 2c). Powstałe dwa fragmenty (160 bp i 192 bp) nie są rozdzielane w wybranych warunkach. Przedstawione są reprezentatywne bieżące ślady koeksprymowanych podtypów typu dzikiego i HCN4-573X wywołanych przez hiperpolaryzujące etapy napięciowe od. 40 mV do. 120 mV w nieobecności (c) lub obecności (d) 8-Br-cAMP. Przedstawiono zależności napięciowe heteromerycznych przewodników typu dzikiego / hHCN4-573X (e) pod nieobecność (czarne kółka) lub obecność (białe kółka) mM 8-Br-cAMP. Linie przerywane wskazują odpowiednie pasma Boltzmanna HCN4 (WT) z lub bez zastosowania 8-Br-cAMP pobrane z Figury 4. Brak pasków błędów wskazuje błędy mniejsze niż rozmiar symbolu. RT-PCR. Względne ilości transkryptów HCN4 typu dzikiego i zmutowanych w eksperymentach koekspresji (Figura 6b) określono w następujący sposób: wyizolowano całkowity RNA z 106 komórek przejściowo transfekowanych pCo-HCN4, pcDNA1Amp-HCN4 lub pcDNA1Amp-HCN4-573X (Purescript Zestaw do izolacji RNA, Biozym, Oldendorf, Niemcy) i poddany odwrotnemu transkrypcji (Superscript II, Invitrogen). Fragmenty cDNA HCN4 zamplifikowano za pomocą PCR, stosując .l reakcji odwrotnej transkrypcji (starter do przodu, 5 -GGCATGTCCGACGTCTGGCTCAC-3 (3, starter odwrotny, 5 -TCACGAAGTT GGGGTCCGC ATTGG-3a). Aby odróżnić dzikie i zmutowane fragmenty PCR, strawiliśmy fragmenty za pomocą EciI (MBI Fermentas, St. Leon-Roth, Niemcy) (patrz Figura 2c) i rozdzielono je za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Uzyskany obraz z kamery CCD (Biometra, Göttingen, Niemcy) żelu barwionego bromkiem etydyny analizowano przy użyciu oprogramowania do analizy obrazów AIDA (Raytest, Sprockhöfel, Niemcy). Hodowla komórek, transfekcja i barwienie immunologiczne Do lokalizacji immunocytochemicznej komórki COS-7 przejściowo transfekowano cDNA typu dzikiego i / lub zmutowanego. Komórki COS-7 wysiewano na szkiełkach nakrywkowych w naczyniach 35 mm dzień przed transfekcją, co przeprowadzono stosując 3,5 .l odczynnika lipofektaminy (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i 1,5 .g odpowiedniego plazmidowego DNA. Dwa dni po transfekcji komórki utrwalono na szkiełku nakrywkowym z 2% paraformaldehydem. Po inkubacji blokującej (1 godzina w 37 ° C z 3% surowicą kozią i 5% albuminą surowicy bydlęcej [Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy] w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem), barwienie immunologiczne przeprowadzono z oczyszczonym przez powinowactwo monoklonalnym anty-myc. przeciwciało (rozcieńczenie, 1: 100, Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) i poliklonalne przeciwciało anty-HA (rozcieńczenie, 1: 500; Babco, Richmond, Kalifornia, USA). Wyznakowane Alexa546 anty-królicze IgG lub znakowane Alexa 488 przeciwciało przeciw mysiej IgG (rozcieńczenie, 1: 2000, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) służyły jako wtórne odczynniki immunofluorescencyjne. Obrazy konfokalne uzyskano w trybie sekwencyjnego skanowania przy użyciu laserowego mikroskopu skaningowego Leica TCS NT (Leica, Bensheim, Niemcy). Zapis elektrofizjologiczny Transfekcję komórek COS-7 do analiz elektrofizjologicznych przeprowadzono jak opisano powyżej, ale bez szkiełek nakrywkowych. Dwa dni po transfekcji komórki podzielono w celu uzyskania gęstości 104 komórek w naczyniu o średnicy 35 mm. Komórki te analizowano następnego dnia
[podobne: mielopatia szyjna, mielopatia, mastocytoza ]

0 thoughts on “karpacz drogi”