Skip to content

integracja sensoryczna gliwice

3 miesiące ago

582 words

Pełnej długości cDNA HCN4 typu dzikiego wklonowano do wektora pcDNA1Amp (Invitrogen), a zidentyfikowaną mutację wprowadzono przez ukierunkowaną mutagenezę. Następnie do cDNA dodano N-końcowe sekwencje epitopów (dziki typ, epitop HA, mutant, epitop myc). Wektor pcDNA1Amp-HCN4 (1 .g) zastosowano do przejściowej ekspresji obu znakowanych dzikich lub zmutowanych kanałów lub kotransfekcji obu konstruktów (Figura 3) w komórkach COS-7 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) . Rycina 3Nieobniżanie barwy HCN4 i HCN4-573X w komórkach COS-7. Kanały typu dzikiego i HCN4-573X ulegały przejściowej ekspresji w komórkach COS-7. W celu detekcji HCN4 typu dzikiego znakowano HA, a HCN4-573X znakowano myc. Oba kanały wykazywały porównywalne immunostany (aib) z immunoreaktywnością wykrywalną w obszarach okołojądrowych i na błonie plazmatycznej. Kiedy koeksprymowano (c. F), wzory barwienia immunologicznego nie zmieniły się i całkowicie zachodziły na siebie i były szczególnie skoncentrowane w błonie komórkowej (f). Eksperymenty elektrofizjologiczne. W celu przejściowej ekspresji i charakteryzacji elektrofizjologicznej kanałów typu dzikiego lub zmutowanych w komórkach COS-7 (Figury 4 i 5), cDNA HCN4 pełnej długości typu dzikiego lub zmutowanego wklonowano do pierwszego polilinkera wektora ekspresyjnego pBud-CE4. (Invitrogen). Ekspresja była zatem kierowana przez promotor CMV (PCMV). W celu umożliwienia selekcji transfekowanych komórek, cDNA kodujący EGFP (wzmocnione białko o zielonej fluorescencji, Clontech, Palo Alto, Kalifornia, USA) został wstawiony do drugiego polilinkera pBud-CE4.1, który zawierał już nieoznakowany pełnowymiarowy (wild- typu lub mutanta) cDNA HCN4 w pierwszym polilinkerze. Do eksperymentów koekspresji (Figura 6) skonstruowano inny plazmid ekspresyjny (pCo-HCN4), który zawierał zmutowany cDNA HCN4-573X w pierwszym polilinkerze pBud-CE4.1 (pod kontrolą PCMV) i HCN4cDNA typu dzikiego w drugi polilinker (pod kontrolą ludzkiego czynnika wydłużania (3 (PEF-1 (3); Figura 6a). Ponadto sklonowano element EGFP z wewnętrznym rybosomalnym miejscem wejścia (IRES) 3. do HCN4 typu dzikiego, aby umożliwić identyfikację transfekowanych komórek. Stąd ekspresja EGFP była sprzężona z ekspresją HCN4 typu dzikiego, ponieważ obie otwarte ramki odczytu znajdowały się w jednym transkrypcie. Figura 4Funkcjonalna charakterystyka homomerycznych kanałów HCN4 i HCN4-573X w komórkach COS-7 w warunkach kontrolnych. Reprezentatywne bieżące ślady kanałów typu dzikiego (a) lub HCN4-573X (c) wywołane pięciosekundowymi skokami napięcia hiperpolaryzującego od. 40 mV do. 120 mV w warunkach kontrolnych. Względne prawdopodobieństwo otwarcia kanałów typu dzikiego (b) i HCN4-573X (d) zależało od czasu trwania testu (szare kółka, 2 sekundy, czarne kółka, 5 sekund, białe kółka, 15 sekund). Brak pasków błędów wskazuje błędy mniejsze niż rozmiar symbolu. Figura 5 Funkcjonalna charakterystyka homomerycznych kanałów dzikiego typu i HCN4A 573X w komórkach COS-7 w obecności 8-Br-cAMP. Pokazano reprezentatywne bieżące ślady kanałów typu dzikiego (a) lub HCN4-573X (c) wywołanych pięciosekundowymi krokami napięcia hiperpolaryzującego od. 40 mV do. 120 mV w obecności 8-Br-cAMP. Zależność napięciowa przewodności typu dzikiego (b) i HCN4-573X (d) pod nieobecność (czarne kółka) lub obecność (białe kółka) mM 8-Br-cAMP. Brak pasków błędów wskazuje błędy mniejsze niż rozmiar symbolu. Figura 6 Funkcjonalna charakterystyka koekspresjonowanych podjednostek HCN4 i HCN4-573X w komórkach COS-7. (a) Schematyczne przedstawienie konstruktu ekspresyjnego stosowanego do eksperymentów koekspresyjnych (nieprzedstawionego na skali). CDNA HCN4 typu dzikiego i zmutowane są zlokalizowane na tym samym plazmidzie (oznaczonym kropkowanymi liniami); kodony inicjacyjne otwartych ramek odczytu są oznaczone poziomymi strzałkami
[podobne: mastocytoza, olx zielona gora, olx strzelin ]

0 thoughts on “integracja sensoryczna gliwice”