Skip to content

gorączka matki karmiącej

3 miesiące ago

544 words

Myszy transgeniczne nadeksprymujące CYP7A1 były chronione przed wywołaną dietą miażdżycą tętnic i tworzeniem kamieni żółciowych (14). Ukierunkowane zaburzenie genów u myszy dało złożony fenotyp ze sprzecznymi doniesieniami o wpływie na lipidy w surowicy (7, 15, 16). Opierając się na przewidywaniu, że mutacje CYP7A1 mogą być związane z hipercholesterolemią i opornością na inhibitory reduktazy HMG-CoA, przebadaliśmy pacjentów z Kliniki Lipidów na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) i kontrolowaliśmy pacjentów pod kątem mutacji genów CYP7A1 stosując denaturujący żel gradientowy elektroforeza (DGGE). Stwierdzono, że pacjent z istotną hiperlipidemią i głęboką opornością na inhibitory reduktazy HMG-CoA niósł mutację CYP7A1. Zbadaliśmy rodzinę tego pacjenta, aby ustalić, czy mutacja jest współekregregowana z chorobą. Mierzono wpływ mutacji na skład i zawartość kwasu żółciowego w kale oraz ich wpływ na odpowiednie aktywności enzymów wątrobowych. Aktywność zmutowanego produktu genu określono przez ekspresję in vitro. Metody Wybór pacjenta i pobieranie próbek. Genomowy DNA rutynowo przygotowywano z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów w Klinice Lipidów w UCSF (17). Próbki wybrano do analizy na podstawie tego, czy pacjent ma poziom cholesterolu LDL w osoczu powyżej 200 mg / dl, albo oporność na inhibitory reduktazy HMG-CoA. Kolejne próbki pobrano od wszystkich dostępnych członków rodziny probantów. Protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań Ludzkich UCSF. Uzyskano świadomą zgodę wszystkich osób na izolację DNA oraz kolekcje osocza i stolca. Dzieci zostały uwzględnione za zgodą rodziców. Pacjent IV-17 zgodził się na biopsję wątroby. Materiał z trzech normalnych wątrób otrzymano z programu zaopatrzenia wątroby w University of Minnesota Medical School. Wykrywanie mutacji. DGGE wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (18). Region kodujący eksonu 6 amplifikowano przy użyciu zamplifikowanych GC primerów 5. -CgcccgccgcgccccgcgcccccccccccgCTTAGCTCATTAAGCTCCTGTTC-3. i 5. -cgcccgccgcgccccgcgcccgtcccgccgcccccgCCACCACTAAATGCATTTGTC-3 .. Przed DGGE próbki trawiono MboI. Osoby wykazujące wzorce zmiany w żelu sekwencjonowano bezpośrednio za pomocą sekwensera ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Mutację 1302-1303delTT potwierdzono przez trawienie Taql zarówno amplikonu ekson 6, jak i pełnej długości cDNA wytwarzanego przez RT-PCR i nested PCR (19), przy użyciu wątroby RNA od pacjenta IV-17. W przypadku RT-PCR stosowano startery 5. -CTTCCTCAGAGATTTTGGCCTAGATTTGC-3. i 5 -CTGTGTGGTGAGGGTGTT-CTGCAGTCCTG-3. i dla zagnieżdżonych starterów do PCR 5a-TTGGgCTAGcTTTGCAAAATGATGACCAC-3. i 5. -TC-ATCTcGaGTCCTCTTATTCCAGCCATG-3 .. Ekspresja CYP7A1 i test enzymatyczny. Wytworzony przez RT-PCR. CDNA od pacjenta kontrolnego i RNA pacjenta (patrz powyżej) oczyszczono na żelu i poddano ligacji z trawionym NheI / XhoI pCDNA3.1 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA) i stosowano do transformacji Escherichia coli (DH5 .). Plazmidowy DNA z kilku klonów został wyizolowany, oczyszczony, a inserty całkowicie zsekwencjonowane. Komórki HEK 293 transfekowano normalnymi i zmutowanymi plazmidami CYP7A1, a zmierzono aktywność 7 (3-hydroksylazy cholesterolu, zasadniczo stosując ustaloną metodę (20). Komórki wysiano w dniu przy gęstości 7 x 105 komórek / 60-mm płytkę. Komórki transfekowano w dniu 2 za pomocą 5 .g DNA na płytkę przy użyciu FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) w stosunku 2: 3. Pożywki zmieniano w dniu 3, aby uzupełnić pożywkę zawierającą 20 mg / ml 2-hydroksypropylo-y-cyklodekstryny (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Po godzinie dodano 1,5 Ci [4-14C] -fenesterolu (53 mCi / mmol; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA) w 15 ul etanolu
[hasła pokrewne: napięciowe bóle głowy, niskorosłość, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów ]

0 thoughts on “gorączka matki karmiącej”